的应用发展非常神速。目前,几乎所有需要分离的大分子有机物分析工作,它都能发挥优势。可以预言,
仪器的应用,将在“农、轻、重、海、陆、空,吃、穿、用”等所有的领域、各行各业无所不在、无所不有。但是,如何用好HPLC是一个最重要的问题。基于作者的长期实践,以下从仪器学理论、分析误差理论、分析化学等多个角度来全面讨论。
1、泵、柱、检测器三者的关系的认识和目前使用者都会存在的问题目前很多研发、使用HPLC的科技工作人员,没有搞清楚或没有完全搞清楚HPLC中的泵、柱、检测器三者的关系。国内外很多制造商只是生产泵、检测器,色谱柱子都是外购件。我们说HPLC是一个系统,是指泵、柱、检测器三者组成的一个完整的系统。如果只生产泵、检测器,就不能说是生产完整的HPLC仪器,只是生产了HPLC的两种部件,再买一根色谱柱组装成一台仪器后出售。所以,这样生产的HPLC系统,到了用户那里,总是不好用或者不大好用。而广大使用者,由于没将HPLC的泵、柱、检测器三者互相影响的关系搞清楚,所以不能将HPLC用到最佳水平(得到误差最小的最佳分析检验测试的数据)。以本人长期的研发和使用HPLC的实践经验,认为研发、使用HPLC时,以下问题特别值得注重:
正确认识、处理HPLC的泵、柱、检测器三者的关系:(1) HPLC是一个系统,必须将泵、柱、检测器三者(三个部件)结合起来才能叫HPLC。三者都合格,联机后的整机系统才有机会合格,但不能肯定系统就会合格。只有泵、柱、检测器三者质量都合格,并且联机后检测结果也合格,才能说明这台HPLC是合格的。
(2) 三个部件都重要,不能偏重哪一方面。三者谁是核心?谁最重要?目前,光谱、色谱工作者对此看法都各不相同、各有表述,我们不必去追究这些。作者觉得应该说三者是一个整体,缺一不可,都很重要。(3)本人经常使用过HPLC,也研发过HPLC仪器,实践使本人深深认识到:必须将三个部件联接起来检验测试,并能达到质量指标要求,才能说这台HPLC达到了质量发展要求。否则,只能说是部件合格,而整机系统不一 定能合格。为什么? 因为:
②柱对泵影响很大:柱堵塞、柱沾污、柱接头漏液等,都会影响泵的压力波动、使流速不稳定,会影响系统不稳,使RSD变坏、峰拖尾、灵敏度降低;
③柱对检测器影响很大:柱效降低(柱塔板数降低)、柱堵塞、柱的新旧程度、接头、管道漏液等,都会影响检测器的检测限、分辨率、噪声、和灵敏度。
请注意:色谱柱是易损件,用户会经常在色谱柱长时间使用后换新柱,此时HPLC系统的泵和检测器基本进入“电子元件失效理论”的盆底,较为稳定了。所以,不会因为换新柱而产生仪器不能使用的问题。特别应该指出的是:用户换新柱后,一般不检测系统的综合指标。如果检测指标,可能就不能够达到原出厂指标(因为泵和检测器经过较经常使用后,质量会会降低,旧泵、新柱、旧检测器三者不能够达到最佳配备),但是不可能影响使用。
用户换新柱不可能影响使用的问题,可以从计量认证标准规范(JJG)得到佐证。JJG检验的仪器,很多是在用仪器,它明确规定被检仪器的指标可以比新出厂的仪器指标低,甚至有些指标因为达不到要求而免检。但我们的制造企业,在仪器出厂前,必须检测系统的指标,只有系统指标达到设计的基本要求时,才算合格,才能出厂。至于用户换新检测器、换新泵、同样都是允许的。
1)色谱峰拖尾:与柱、流动相的流速、试样等有关,发现拖尾一定要从这样一些方面查找原因;
2)如何延长色谱柱寿命:保养很重要,长期不用时用甲醇浸泡着,严控洗柱时间或洗柱溶剂体积,一般常常使用的柱,下班时应该用甲醇(或水:甲醇为20:80)洗 45分钟或20倍床体积;
3)一定要注意对“柱外效应”的控制。所谓“柱外效应”,就是指HPLC系统中,除柱系统外,管路、连接件、进样器和流动池的死体积等引起的色谱峰增宽效应。
4) 进样:自动进样时,应该经常检测自动进样器,对仪器进样器要求稳定可靠;手动进样时,应该格外的注意取样时的细节,进样时的手感(轻、重、缓、急)等。
1)色谱柱的柱效:塔板数高者好,特别要注意影响柱效的因素,塔板数降到某些特定的程度该柱就报废了。
4)色谱柱使用后一定要进行清理洗涤,防止造成腐蚀、阻塞、降低塔板数。一般应该用20倍床体积冲洗,隔几天再用的HPLC,最好用20%甲醇:80%水冲洗30分钟左右后,再用纯甲醇冲洗20分钟 后保存。
1)PH值很重要:一般C18柱PH小于3时,容易损坏色谱柱,但是抗酸性的柱能够正常的使用小的PH值。
2) 留意选择试剂的截止波长:如乙腈截止波长215nm、丙酮截止波长330nm、正丁烷210nm等等(详细情况请读者参阅本文的参考文献)。
3)流速:流速要适当,否则影响峰形、浪费溶剂,一般常规分析工作大多选择1ml/min。
溶剂进泵前和样品注射前应该过滤除去溶剂中的微小颗粒、微生物,保证泵和色谱柱不会堵塞或损坏,保证分析数据可靠。
2)对过滤器的要求和最佳孔径选择方法:对过滤器总的要求:速度快、溶出度小、死体积小、精确的孔径、体积适当、化学兼容性好等。
最佳孔径选择方法:如果色谱柱填料直径小于3µm或除菌过滤,一般选择0.2µm孔径;如果色谱柱填料直径大于5µm,则选0.45µm;如果是预过滤或过滤难过滤的样品,一般选1µm孔径。特别是对使用无机盐配制的缓冲液,更要留意选择合适的过滤器!否则,不可能得到可靠的分析测试数据!
主要目的是:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡。液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。流动相的气泡进入液相泵会引起压力的上下波动,危害很大,必须除之,能打开排空阀,大流速冲洗。
4)梯度洗脱时,选低吸收值的缓冲液 :例如:梯度洗脱时,缓冲液与有机相应预混,以防止析盐。在保证峰不拖尾的情况下,尽可能选用低浓度的缓冲盐,防止析盐; 缓冲盐浓度,一般用20~30mM基本上就可以了,如果流动相中有机相含量高的话,流动相中的盐类缓冲液浓度就不能过高,盐的浓度起码要保证在流动相条件下不会析出。离子对缓冲液浓度要高一点,一般50~100mM。
这12个问题是作者的经验总结,是用好HPLC的科技工作人员一定要重视的问题。(请读者参考《李昌厚,高效液相色谱仪器及其应用,北京:科学出版社,2014》一书)。
进样器或进样针请注意三点:A、对进样器要求:自动进样和取样速度快、有些仪器进样时间仅17秒。
国际上科技工作人员对HPLC的线性动态范围的定义是:最大线%相对误差的线性区域)的吸光度值Amax
,即LDR=Cmax/Cmin。2)HPLC的线性动态范围的重要性(对分析测试误差的影响)定量分析检测时,如果HPLC使用在非线性动态区,肯定会因非线性而产生误差。为了能够更好的保证分析测试结果的可靠性,我们应使用在HPLC的线性动态区。因此,线性动态范围是一切HPLC使用者必须格外的重视的技术指标。一般来说,使用者拿到一台HPLC仪器后,总是希望对很稀的样品分析时,其分析测试的结果在所要求的误差范围内。对很浓的样品分析时,其分析测试的结果也在所要求的误差范围内。这就只有HPLC的线性动态范围很宽的时候才能做到。有的人觉得,样品太稀时,浓缩一下就好了,样品太浓时,稀释一下就是了。这是不了解分析工作或未亲自作过分析工作的人说的话。因为,浓缩一下或稀释一下谈何容易?首先是增加工作量,稀释或浓缩工作很麻烦;第二,稀释或浓缩会带来误差。所以我们总是希望HPLC的线性动态范围大(宽)且好。HPLC的线性动态范围,一般取决于仪器检测器的噪声和杂散光。国内外很多HPLC的制造商不给出HPLC的线性动态范围。作者觉得不给线性动态范围是不对的,因为不给线性动态范围,就从另一方面代表着不知道这台HPLC分析的样品浓度的上限和下限。综上所述,HPLC的线性动态范围很重要,它将限制仪器的应用限制范围(即限制仪器的适用性)。很遗憾的是许多科技工作人员目前还未对线性动态范围引起重视。3)线性动态范围测试方法
HPLC的线性动态范围的测试方法有多种。我国的计量检定规程JJG705-2002规定:波长254nm时,采用“丙酮/2%异丙醇水溶液(丙酮含量为0.1%、0.2%、....1.0%)冲洗检测池,并记下各溶液对应的稳定记录仪读数;由C
浓度下限)。”作者觉得这种方法很不妥。因为浓度的下限是计算出来的,不是真正测试出来的下限。采用的计算公式为:C
=2NCV/H×20(公式本身有错误);并且算出的下限值达到千万分之三点一(即:0.000031%)。这样的数据有什么意义?作者觉得这种测试线性范围的测试方法既不符合仪器学理论,又不与国际接轨,有关部门应该尽快更正。目前,国际上对线性动态范围的测试方法,一般是配置不同浓度的标准样品(以数量级递增),直接在仪器上测试其吸光度。求出偏离比耳定律1%时的最大吸光度Amax和最小吸光度Amin。二者相除即是仪器的线性动态范围LDR(Linine Dinamic Rangi)。即LDR=Amax/Amin。其具体操作是:HPLC仪器设置纵坐标为吸光度A,横坐标为浓度C;检测器的光谱带宽为2nm;波长设置可以在紫外区(如要求很高时可设置在253.7nm),也可在可见区(如500nm);试样可任选,浓度从小到大,依次对所配试样来测试。作曲线,从曲线%以内的范围。此范围内的A
/Amin就是线性动态范围。作者在研发HPLC的UV/FLD时,就是根据仪器学理论,从线性动态范围的物理概念出发,自己配置蒽不同浓度的溶液,以数量级递增,测出能保证1%相对误差的下限点和上限点,二者相除,得出其线性动态范围,效果很好。主要参考文献:
主要研究方向:分析仪器及其应用研究。长期从事光谱仪器(紫外吸收光谱、原子吸收光谱、旋光光谱、分子荧光光谱、原子荧光、拉曼光谱等)、色谱仪器(液相色谱、气相色谱等)及其应用研究,;特别对《仪器学理论》等有精深研究;以第一完成者身份,完成科研成果15项。由中科院组织专家鉴定,其中13项达到鉴定时国际上同类仪器的领先水平,2项填补国内空白;以第一完成者身份获得国家级和省部级科技成果奖5项(含国家发明奖1项);发表论文183篇,出版专著5本;现任中国仪器仪表学会理事、《生命科学仪器》付主编;曾任中国仪器仪表学会分析仪器分会第五届、第六届付理事长;国家认监委计量认证/审查认可国家级常任评审员、国家科技部“十五”、“十一五”、“十二五”和“十三五”重大仪器及其应用专项的技术专家组成员或组长、上海市科学仪器专家组成员、《光学仪器》副主编、《光谱仪器与分析》副主编等十多个学术团体的领导职务和专家委员会成员等。
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